• ×

    PCR擴增產物的克隆

    標簽: PCR 擴增 克隆

    PCR擴增產物的克隆可以:(1)獲得目的DNA片段;(2)用于原核表達的研究;(3)廣泛應用于分子生物學相關研究。

    0人關注

    分享本實驗

    實驗方法原理

    平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭;PCR產物純化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。

    如果要求不高,PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,這兩種酶有5’→3’校對能力,擴增出來的PCR產物已經是平頭,可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下,即使使用很高單位的連接酶,或在反應體系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。

    通常情況下,PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接,但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性,能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基,使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

    這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高,在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時,可顯著提高其連接效率。

    對于較短PCR產物,用PUS19的HincⅡ位點進行克隆,以X-gal和IPTG篩選,常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA,然后再用平端連接法克隆PCR產物。

     

    實驗材料

    模板DNA

    試劑、試劑盒

    SauI Klenow片段 T4連接酶

    儀器、耗材

    移液器 移液器吸頭 PCR小管 DNA擴增儀 電泳槽 電泳儀 臺式高速離心機


    誰關注這個實驗
    246天天好彩蓝月亮精选